Купить ГОСТ Р 53601-2009 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее
Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО "ЦНТИ Нормоконтроль"
Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.
Устанавливает метод идентификации и количественного определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в молоке, молочной продукции, яйцах, яичном порошке, меде, органах и тканях животных с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 1,0 до 1000,0 мкг/кг.
1 Область применения
2 Нормативные ссылки
3 Сущность метода
4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы, реактивы
5 Требования безопасности
6 Порядок подготовки к проведению измерений
6.1 Отбор проб
6.2 Подготовка хромато-масс-спектрометрической системы к выполнению измерений
6.3 Приготовление растворов
6.4 Хроматографические условия измерений
6.5 Построение градуировочной характеристики
6.6 Подготовка лабораторной посуды и реактивов
7 Порядок выполнения измерений
7.1 Обработка проб органов, тканей животных, яиц, яичного порошка, молока, молочных продуктов и меда
7.2 Проведение твердофазной экстракции и подготовка к хроматографированию
7.3 Обработка проб молока
7.4 ВЭЖХ-МС/МС анализ
7.5 Контроль качества измерений
7.6 Обработка результатов хроматографического анализа
8 Метрологические характеристики
9 Оформление результатов измерений
10 Контроль качества результатов измерений
10.1 Контроль полноты извлечения внутреннего стандарта тетрациклинов
10.2 Контроль неопределенности результатов измерений
Приложение А (справочное) Структурные формулы антибиотиков тетрациклинового ряда
Приложение Б (справочное) Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона внутреннего стандарта
Приложение В (обязательное) Контроль стабильности результатов измерений
Библиография
Дата введения | 01.01.2011 |
---|---|
Добавлен в базу | 01.09.2013 |
Завершение срока действия | 15.02.2015 |
Актуализация | 01.01.2021 |
15.12.2009 | Утвержден | Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии | 914-ст |
---|---|---|---|
Разработан | ФГУ ВГНКИ | ||
Издан | Стандартинформ | 2010 г. |
Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:
ГОСТР
53601-
2009
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
НАЦИОНАЛЬНЫМ
СТАНДАРТ
РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ
Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором
Издание официальное
Москва
Стандартинформ
2010
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 декабря 2009 г. № 914-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
© Стандартинформ, 2010
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен в качестве официального издания без разрешения Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии
9.1 Результат анализа Мс в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде формулы
Мс — Хпс i ^Л|,С. (1)
где Хп с — среднеарифметическое значение двух параллельных измерений содержания л-го антибиотика в анализируемой пробе, мкг/кг;
±Unc — расширенная неопределенность при коэффициенте охвата к = 2 определения содержания л-го антибиотика тетрациклиновой группы, определяемая по формуле 2, мкг/кг.
9.2 Значения расширенной неопределенности измерения рассчитывают с использованием значений относительной расширенной неопределенности при к = 2 (в соответствии с таблицей 2) по формуле
(2)
II = У Ч) Unc Хп'с 100
где Хп с — среднеарифметическое значение двух параллельных измерений содержания л-го антибиотика в анализируемой пробе, мкг/кг,
Vn — значение относительной расширенной неопределенности содержания л-го антибиотика тетрациклиновой группы для соответствующего диапазона измерений (таблица 2).
10.1.1 Контроль извлечения внутреннего стандарта тетрациклинов выполняют в ходе каждого измерения (получения результата количественного химического анализа при соблюдении требований
настоящего стандарта).
10.1.2 Рассчитанные программным обеспечением значения извлечения внутренних стандартов должны находиться в диапазоне от 40 % до 130 %. Если рассчитанное значение извлечения ниже или выше указанного диапазона, то результаты измерения массовой доли тетрациклинов не принимают за окончательный результат. Проводят повторные исследования анализируемых проб.
При проведении испытаний рекомендуется в ходе анализа каждой серии образцов с использованием стандартной процедуры пробоподготовки (см. 7.1 и 7.3) проводить анализ градуировочных растворов в соответствии с 6.4. Результаты измерений признают удовлетворительными при выполнении следующего неравенства:
|Xn,c-Xn,a|<^Xn,c.-^j (3)
гдеХп с—рассчитанное с помощью градуировочной характеристики значение содержания л-го антибиотика тетрациклиновой группы в анализируемой пробе, мкг/кг;
Хпа — значение содержания л-го антибиотика по паспорту на стандартный образец, мкг/кг;
Vn — значение относительной расширенной неопределенности содержания л-го антибиотика тетрациклиновой группы для соответствующего диапазона измерений (таблица 2), %.
8
Приложение A (справочное)
Структурные формулы антибиотиков тетрациклинового ряда |
4-эпихлортетрациклин |
Окситетрацикпин |
9
Приложение Б (справочное)
Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона внутреннего стандарта
Концентрация, мкг/кг |
Рисунок Б.1 — Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона внутреннего стандарта
10
Контроль стабильности результатов измерений
Периодичность контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории.
Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности рутинного анализа с изменяющимися факторами «время» и «оператор».
Применяя метод контрольных карт Шухарта, проверяют стабильность этих результатов измерений и оценивают стандартное отклонение промежуточной прецизионности с изменяющимися факторами «время» и «оператор». После отбора испытуемую пробу от каждой партии подготавливают в лаборатории для анализа. Одну пробу, подвергавшуюся анализу во время смены (С.,), анализирует повторно другой оператор в другую смену (С2), и результаты сравнивают. Значение стандартного отклонения промежуточной прецизионности (одт о)) устанавливают в лаборатории по результатам измерений за предыдущий период. Параметры контрольной карты пределов для каждого диапазона рассчитывают следующим образом:
- среднюю линию по формуле
^2' стдт,о) 1,128 ст/(7-0), где Оду-о) — среднеквадратическое отклонение промежуточной прецизионности, %;
(4)
- верхний предел действия по формуле
UCLr = 3,686 ■ ст/(г0); (5)
- верхний предел предупреждения по формуле
UCLn = 2,834 ■ а-/(г0). (6)
Расхождение (w) рассчитывают по формуле
lv _2 |С1-С2|-100 (7)
(С1 + С2)
Расхождение w наносят на карту в течение контролируемого периода.
Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30. После этого проводят оценку стандартного отклонения промежуточной прецизионности (S^r 0j) результатов по формуле
S/(T, О)
П
м
mnd2’
(8)
где тп — число измерений.
Полученное значение S^T используют для последующего контроля стабильности результатов измерений.
11
Библиография
[1] Пипетки переменного объема одноканальные, Transferpettor Brand, Германия
[2] Виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 и 50 см3, Corning 430790 и 430290
[3] Фильтры мембранные с размером пор 0,5 мкм, Acrodisc CR13 мм, 0,2 мкм, Life Sciences PN 4423Т
[4] Измельчитель-гомогенизатор лабораторный MMR 0801/01, Bosch, Германия
[5] Вибрационный встряхиватель для пробирок (вортекс) Multi Reax, Heidolph, Германия
[6] Центрифуга лабораторная роторная рефрижераторная, Beckman, Германия
[7] Термостатируемый нагревательный модуль с системой отдувки растворителей инертным газом, Reacti-Therm (Pierce, США)
[8] Ультразвуковая баня, Elma S 30 И, Г ермания
[9] ТУ 6-09-1709-77 Метанол-яд для хроматографии (метиловый спирт) х.ч.
[10] ТУ 7-09-5437-91 Ацетонитрил ч.д.а.
[11] ФС 42-2619-97 Вода очищенная
[12] Стандартный образец тетрациклина гидрохлорида, USP, Sigma, Т4062
[13] Стандартный образец окситетрацикпина гидрохлорида, USP, Sigma, 05875
[14] Стандартный образец хлортетрацикпина гидрохлорида,USP, Sigma, С4881
[15] Стандартный образец доксицикпина, USP, Sigma, D9891
[16] Стандартный образец демекпоцикпина, USP, Sigma, D6140
[17] Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением
[18] Методические указания по отбору проб пищевой продукции животного и растительного происхождения, кормов, кормовых добавок с целью лабораторного контроля их качества и безопасности
УДК 637.638:614.3:006.354 ОКС 67.050 Н09
67.100 Н19
67.120 Н11
Ключевые слова: пищевые продукты, продовольственное сырье, антибиотики тетрациклиновой группы, метод определения содержания с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием
Редактор Л.В. Коретникова Технический редактор Н.С. Гоишанова Корректор М.С. Кабашова Компьютерная верстка И.А. Налейкиной
Сдано в набор 06.09.2010. Подписано в печать 04.10.2010. Формат 60 х 84%. Бумага офсетная. Гарнитура Ариап. Печать офсетная. Уел. печ. л. 1,86. Уч.-изд. л. 1,40. Тираж 201 экз. Зак. 781.
ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ», 123995 Москва, Гранатный пер., 4. www.gostinfo.ru info@gostinfo.ru
Набрано во ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» на ПЭВМ.
Отпечатано в филиале ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ» — тип. «Московский печатник», 105062 Москва, Лялин пер., 6.
1 Область применения...................................................1
2 Нормативные ссылки..................................................1
3 Сущность метода.....................................................2
4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы, реактивы..............2
5 Требования безопасности...............................................3
6 Порядок подготовки к проведению измерений...................................4
6.1 Отбор проб......................................................4
6.2 Подготовка хромато-масс-спектрометрической системы к выполнению измерений........4
6.3 Приготовление растворов.............................................4
6.4 Хроматографические условия измерений...................................5
6.5 Построение градуировочной характеристики.................................5
6.6 Подготовка лабораторной посуды и реактивов................................6
7 Порядок выполнения измерений...........................................6
7.1 Обработка проб органов, тканей животных, яиц, яичного порошка, молока, молочных
продуктов и меда.....................................................6
7.2 Проведение твердофазной экстракции и подготовка к хроматографированию............6
7.3 Обработка проб молока..............................................7
7.4 ВЭЖХ-МС/МС анализ...............................................7
7.5 Контроль качества измерений..........................................7
7.6 Обработка результатов хроматографического анализа..........................7
8 Метрологические характеристики...........................................7
9 Оформление результатов измерений........................................8
10 Контроль качества результатов измерений....................................8
10.1 Контроль полноты извлечения внутреннего стандарта тетрациклинов................8
10.2 Контроль неопределенности результатов измерений...........................8
Приложение А (справочное) Структурные формулы антибиотиков тетрацикпинового ряда........9
Приложение Б (справочное) Отношение площади пика иона антибиотика к площади пика иона
внутреннего стандарта........................................10
Приложение В (обязательное) Контроль стабильности результатов измерений..............11
Библиография........................................................12
Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором
Food products, food raw materials.
Method for determination of the antibiotic residues of tetracycline group by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (HPLC-MS)
Дата введения — 2011—01—01
Настоящий стандарт устанавливает метод идентификации и количественного определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы в молоке, молочной продукции, яйцах, яичном порошке, меде, органах и тканях животных с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 1,0 до 1000,0 мкг/кг.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р51447—99 (ИСОЗЮО-1—91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб ГОСТ Р 52121-2003 Яйца куриные пищевые. Технические условия
ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требований безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.2.085-2002 Сосуды, работающие под давлением. Клапаны предохранительные. Требования безопасности
ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия
ГОСТ 908-2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Техн ические условия
ГОСТ 3622-68 Молоко и молочные продукты. Отбор проб и подготовка их к испытанию ГОСТ 5848-73 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия
ГОСТ 8981-78 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия
ГОСТ 10652-73 Реактивы. Соль динатриевая этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия
Издание официальное
ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначения чистоты
ГОСТ 19792-2001 Мед натуральный. Технические условия
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования1
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1:1981) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 30364.0-97 Продукты яичные. Методы отбора проб и органолептического анализа
Примечание — При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3.1 Определение остаточных количеств антибиотиков тетрацикпиновой группы проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС).
ВЭЖХ метод обеспечивает хроматографическое разделение антибиотиков тетрацикпиновой группы и их эпи-форм (приложение А).
3.2 Количественное определение остаточного содержания антибиотиков тетрацикпиновой группы проводят методом внутреннего стандарта по сумме площадей пиков идентифицированных соединений и их эпи-форм для каждого антибиотика при помощи градуировочной кривой.
3.3 Детектирование анализируемых проб проводят в режиме регистрации выбранных реакций.
4.1 При определении содержания антибиотиков тетрацикпиновой группы применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование и материалы:
- масс-спектрометр с диапазоном измерения от 100 до 500 атомных единиц массы (а.е.м.), массовым разрешением не менее 500, точностью измерения массы не ниже 0,2 а.е.м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС);
- систему высокоэффективную жидкостную хроматографическую, состоящую из бинарного насоса со смесителем; термостата хроматографической колонки, обеспечивающего температуру нагрева до 50 °С;
- компьютер с установленным программным обеспечением для управления масс-спектрометром и обработки результатов масс-спектрометрических измерений;
- весы лабораторные по ГОСТ 24104, высокого или специального класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 и 500 г с ценой поверочного деления 0,1 и 1,0 мг соответственно;
- pH-метр с набором электродов, с пределами абсолютной погрешности измерений + 0,01 pH;
- пипетки одноканальные переменного объема 10—100 мм3, 40—200 мм3, 200—1000 мм3, 1—5 см3 [1];
- пробирки мерные стеклянные П-1-5-0,1ХС, П-2-10-14/23 по ГОСТ 1770;
- пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227;
- колбы мерные стеклянные К-2-100-2, К-2-1000-2 по ГОСТ 1770;
- виалы (флаконы полипропиленовые) вместимостью 15 и 50 см3 с герметично закрывающимися пластмассовыми крышками [2];
- фильтры мембранные с размером пор не более 0,5 мкм [3];
- измельчитель-гомогенизатор лабораторный [4];
- встряхиватель вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм и диапазоном скоростей от 150 до 2500 об/мин [5];
- центрифугу лабораторную рефрижераторную со скоростью вращения ротора не менее 10000 об/с и диапазоном температур охлаждения от 4 °С до 20 С, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см2 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см2 [6];
- модуль термостатируемый нагревательный с системой отдувки растворителей инертным газом и максимальной температурой термостатирования 40 °С [7];
- баню ультразвуковую с рабочей частотой не менее 20 Гц и объемом не менее 1 дм2 [8];
- колонку хроматографическую обращенно-фазную длиной не менее 50 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм;
- устройство вакуумное для твердофазной экстракции;
- картридж для твердофазной экстракции объемом не менее 12 см2, заполненный обращенно-фазным сорбентом с диаметром частиц не более 50 мкм;
- камеру лабораторную морозильную с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 18 °С до минус 24 °С;
- холодильникбытовой с морозильной камерой, цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °С до 5 °С.
4.2 При определении содержания антибиотиков тетрациклиновой группы применяют следующие реактивы:
- кислоту лимонную пищевую по ГОСТ 908, высшего сорта;
- метанол х.ч. [9];
- ацетонитрил ч.д.а. [10];
- деионизованную воду [11];
- бидистиллированнуюводу[11];
- муравьиную кислоту ч.д.а. по ГОСТ 5848;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный дигидрат ч.д.а. по ГОСТ 245;
- соль динатриевую этилендиаминтетрауксксной кислоты (трилон Б) по ГОСТ 10652;
- ортофосфорную кислоту по ГОСТ 6552;
- этилацетат по ГОСТ 8981;
- ацетон по ГОСТ 2603;
- стандартный образец тетрациклина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90% [12];
- стандартный образец окситетрацикпина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90 % [13];
- стандартный образец хлортетрацикпина гидрохлорида с содержанием действующего вещества не менее 90 % [14];
- стандартный образец доксицикпина с содержанием действующего вещества не менее 90 % [15];
- стандартный образец демеклоцикпина с содержанием действующего вещества не менее 90 %
[16].
Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867.
5.1 Используемые в работе реактивы относятся к веществам 1-го и 2-го классов опасности по ГОСТ 12.1.007, при работе с ними необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.
5.2 Помещения, в которых проводят анализ и подготовку проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией.
5.3 Операции по приготовлению и дозированию градуировочных растворов следует проводить под тягой в вытяжном шкафу.
5.4 В связи с тем, что при работе на хромато-масс-спектрометре используется сжатый азот, следует соблюдать требования ГОСТ 12.2.085 и правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением [17].
5.5 При выполнении измерений на хромато-масс-спектрометре следует соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.
5.6 К выполнению измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии — масс-спектрометрии допускаются лица, владеющие техникой ВЭЖХ-МС/МС и изучившие инструкции по эксплуатации исследуемой аппаратуры.
6.1.1 Отбор проб проводят в соответствии с методическими указаниями по отбору проб пищевой продукции с целью лабораторного контроля качества и безопасности, утвержденными федеральным органом исполнительной власти по ветеринарному и фитосанитарному надзору [18].
6.1.2 Отбор проб органов, тканей животных и птицы производят в соответствии с ГОСТ Р 51447. Масса средней пробы органов, тканей животных и птицы не менее 200 г.
6.1.3 Отбор проб молока и молочных продуктов производят в соответствии с ГОСТ 3622. Объем средней пробы молока не менее 200 см3, масса средней пробы образцов молочных продуктов не менее 250 г.
6.1.4 Отбор проб меда производят в соответствии с ГОСТ 19792. Масса средней пробы меда не менее 200 г.
6.1.5 Отбор проб яиц и яичного порошка производят в соответствии с ГОСТ Р 52121 и ГОСТ 30364.0. От яиц в качестве средней пробы отбирают не менее 12 шт.; масса средней пробы яичного порошка не менее 200 г.
Подготовку хромато-масс-спектрометра к работе осуществляют в соответствии с техническим руководством по эксплуатации прибора.
- температура окружающего воздуха...........от 20 °Сдо25 °С;
- атмосферное давление...................от 84 до 106 кПа;
- напряжение в электросети.................(220+ 10) В;
- частота тока в электросети.................от 49 до 51 Гц;
- относительная влажность воздуха............от 40% до 80%.
6.3 Приготовление растворов
При этом должны быть соблюдены следующие условия:
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 21 г лимонной кислоты, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.
Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 35,6 г двузамещенного фосфата натрия, растворяют в деионизированной воде и доводят объем до метки этим же растворителем.
Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.
Для приготовления буферного раствора смешивают в соотношении 60:40 растворы лимонной кислоты и гидрофосфата натрия, полученные по 6.3.1 и 6.3.2, добавляют 37,2 гтрилона Б, измеряют pH и, при необходимости, доводят значение pH до 4,0 ортофосфорной кислотой.
6.3.4.1 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см3 приливают деионизованную воду, добавляют 5 см3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки деионизованной водой.
Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.
6.3.4.2 Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см3 приливают метиловый спирт, добавляют 5 см3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки метиловым спиртом.
Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.
6.3.5.1 Приготовление градуировочных растворов тетрациклинов
Для приготовления градуировочных растворов тетрациклинов на весах с наибольшим пределом взвешивания 500 г взвешивают по 10 мг каждого стандартного образца по 4.1 (кроме демеклоциклина) и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см3. Добавляют метанол, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин и доводят полученный раствор до метки метанолом.
Массовая концентрация каждого антибиотика тетрациклиновой группы в растворе С0 составляет 1 мг/см3.
Срок хранения раствора — 3 мес при температуре минус 20 °С.
4
6.3.5.2 Приготовление раствора демеклоциклина (внутреннего стандарта)
Для приготовления раствора внутреннего стандарта на весах с наибольшим пределом взвешивания 500 г взвешивают 10 мг стандарта демеклоциклина гидрохлорида и переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см3. Добавляют метанол, помещают в ультразвуковую баню на 1 мин, доводят полученный раствор до метки метанолом.
Массовая концентрация внутреннего стандарта в растворе составляет 1 мг/см3. Путем нескольких разбавлений доводят массовую концентрацию раствора внутреннего стандарта до значения 1 мкг/см3. Раствор с данной концентрацией используют для внесения в исследуемые образцы.
Срок хранения раствора — 3 мес при температуре минус 20 °С.
Перед применением растворы выдерживают при комнатной температуре, в темном месте, не менее 20 мин.
6.4.1 Хромато-масс-спектрометр включают и настраивают в соответствии с техническим руководством по его эксплуатации и устанавливают следующие хроматографические параметры:
- скорость потока элюента — 200 мм3/мин;
- объем вводимой пробы — 20 мм3.
6.4.2 Детектирование пиков проводится методом «регистрации выбранных реакций»1). Для каждого антибиотика тетрацикпиновой группы измеряется сигнал для двух фрагментных ионов согласно таблице 1.
Таблица 1 — Значения масс ионов-предшественников и ионов-фрагментов | |||||||||||||||||||||
|
Более интенсивный пик (верхний в каждой строке таблицы 1) служит для определения концентрации антибиотика, второй (нижний в каждой строке таблицы 1) используется для подтверждения правильности определения. Пики ионов-фрагментов с массой 410,1 тетрациклина и доксицикпина различаются по времени их удержания в хроматографической колонке, определяемому на стадии разработки ВЭЖХ-МС/МС метода.
6.5.1 Градуировочную кривую строят при помощи матричной градуировки. Для этого проводят обработку «чистых» проб, приготовленных и проанализированных ранее в соответствии с требованиями раздела 7, не содержащих тетрацикпинов более 1 мкг/кгдля каждого из антибиотиков, в зависимости от типа исследуемой матрицы. На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в мерную пробирку вместимостью 5 см3, содержащую исследуемую «чистую» пробу, добавляют градуировочный раствор тетрациклинов по 6.3.5.1 с таким расчетом, чтобы окончательные массовые концентрации находились в пределах от 1 до 1000 нг/см3. Затем добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта по
6.3.5.2 и необходимое количество мобильной фазы А по 6.3.4.1, доводя объем до 1 см3.
6.5.2 Для получения градуировочных данных используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов.
1)
' «Регистрация выбранных реакций» — режим работы масс-спеткрометра, при котором детектируется ионный ток только для выбранных фрагментных ионов выбранных ионов-прекурсоров.
5
6.5.3 При построении градуировочной зависимости для количественного определения тетрацик-линов анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в 6.2 и 6.4. Затем строят графики зависимости массовой концентрации антибиотика тетрацик-линовой группы от отношения площади хроматографического пика антибиотика тетрациклиновой группы к площади пика внутреннего стандарта для каждого фрагментного иона четырех антибиотиков тетрациклиновой группы. Образец графика приведен в приложении Б.
Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи программы Excel (Microsoft Office).
6.5.4 Расчетные концентрации для обоих фрагментных ионов каждого антибиотика тетрациклиновой группы должны совпадать в пределах 20 %.
Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное значение квадрата коэффициента корреляции для градуировочной кривой каждого фрагментного иона каждого антибиотика тетрациклиновой группы не менее 0,98.
6.6.1 Мойку и сушку посуды следует проводить в отдельном помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией. Не допускается проведение подготовки посуды в данном помещении для других видов анализов. Для сушки лабораторной посуды и подготовки реактивов необходимо использовать отдельные сушильные шкафы.
6.6.2 Стеклянную посуду подвергают стандартной процедуре очистки лабораторной посуды с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).
6.6.3 Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую баню. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от 105 °С до 110°С.
7.1.1 Мышечную ткань предварительно очищают от грубой соединительной ткани. Яйца отделяют от скорлупы. Каждую пробу измельчают на гомогенизаторе и взвешивают по 1,0 г гомогенизированной пробы в виале на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г. В виалу добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.6.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 10 см3 экстракционного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Процедуру экстракции и центрифугирования повторяют еще один раз. Объединенные экстракты собирают в чистые виалы.
7.1.2 1,0 г меда взвешивают на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г в виале вместимостью 50 см3. В виалу добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.6.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 20 см3 экстракционного буферного раствора по 6.3.3, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 1 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин.
7.2.1 Для проведения твердофазной экстракции картридж для ТФЭ заполняют 0,5 г сорбента. Предварительно картридж кондиционируют 6 см3 метилового спирта и уравновешивают 6 см3 бидистил-л ированной воды. Затем наносят объединенный экстракт и вновь промывают 6 см3 бидистиллированной воды. Тетрацикпины элюируют с сорбента при помощи 6 см3 мобильной фазы Б. Полученный элюат упаривают на нагревательном модуле в токе воздуха до 0,5 см3 при температуре 40 °С.
7.2.2 Для перерастворения и подготовки кхроматографированию объем полученного упаренного элюата в мерной пробирке вместимостью 10 см3 доводят до 1 см3 при помощи мобильной фазы А и помещают на ультразвуковую баню на 1 мин. Полученный экстракт фильтруют через мембранный фильтр и используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.
6
7.3.1 Для очистки образцов к навеске образца молока массой 1 г, помещенной в виалу, добавляют 100 мм3 раствора внутреннего стандарта по 6.3.6.2 и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 3 см3 ацетонитрила, закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 3 мин, затем оставляют на 15 мин в горизонтальном положении для последующего уравновешивания. Далее виалу с образцом помещают на предварительно охлажденную до 4 °С центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин. Полученный раствор переносят в мерную пробирку вместимостью 10 см3 и упаривают до 1 см3 на нагревательном модуле в токе воздуха при температуре 40 °С. К полученному остатку добавляют 9 см3 буферного раствора 6.3.3 и помещают на ультразвуковую баню.
7.3.2 Процедуру твердофазной экстракции осуществляют в соответствии с 7.2.1, а перерастворе-ние и подготовку к хроматографированию — в соответствии с 7.2.2.
7.4.1 Для определения остаточного содержания тетрацикпинов и их эпиформ проводят анализ в условиях, указанных в 6.4.
7.4.2 Время удерживания антибиотиков тетрациклиновой группы определяют при анализе градуировочных растворов.
7.5.1 Каждая серия измерений включает в себя несколько степеней подтверждения качества измерений.
7.5.2 Для исключения контаминации образца используемыми реагентами проводят обработку «чистого образца» в соответствии с 7.1—7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.
7.5.3 Для учета матричного эффекта при расчете остаточных содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы используют матричную градуировку по 6.5.
7.5.4 Проводят испытание образца с обработкой пробы в соответствии 7.1—7.3 в зависимости от типа исследуемой матрицы.
7.6.1 Расчеты содержания антибиотика тетрациклиновой группы выполняют с помощью градуировочной характеристики следующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров поставляемой вместе схро-мато-масс-спектрометром. Затем, для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. Ордината этой точки является искомым содержанием (приложение Б).
7.6.2 Окончательные результаты измерений содержания тетрацикпинов округляют до целого значения и выражают в микрограммах на килограмм.
8.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений содержания тетрацикпинов с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к= 2, указанной в таблице 2.
Примечание — Значения относительной расширенной неопределенности, указанные в таблице 2, соответствуют границам относительной погрешности результатов измерений при Р = 0,95.
Табл и ца 2 — Значения относительной расширенной неопределенности измерений (при коэффициенте охвата к =2) V, %, в диапазонах измерений содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы, мкг/кг | |||||||||||||||||||||||
|
1
С1 января 2010 г. действует ГОСТ Р 53228-2008 в части вновь разрабатываемых и модернизируемых весов; с 1 января 2013 г. — в части весов, разработанных до 1 января 2010 г.
2